Components
۱۰۰ml
Phosphoric acid85%
۱
۵۰ml
Ethanol 95%
۲
۷۵۰ml
distilled water
۳
۱۰۰mg
Coomassie blueG-250
۴
بعد از تهیه محلول فوق، به وسیله کاغذ واتمن فیلتر گردید و در یک ظرف تیره رنگ نگهداری گردید.
۳-۸-۲-۲-۳. روش کار
۱۰۰ میکرولیتر از هر نمونه مجهول با ۱۰۰ میکرولیتر ازNaOH 1 مولار به خوبی مخلوط گردید.
بعد به آن ۵ میلیلیتر از محلول برادفورد اضافه گردید و دوباره به خوبی مخلوط گردید.
برای تهیه نمونه شاهد، ۱۰۰ میکرولیتر آب مقطر با ۱۰۰ میکرولیتر از NaOH 1 مولار مخلوط گردیده، و به آن ۵ میلیلیتر از محلول برادفورد اضافه گردید.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
آنها به مدت ۵ دقیقه در دمای محیط انکوبه گردیدند.
پس از انکوباسیون، شاهد در کوت ریخته میشد و داخل دستگاه اسپکتروفتومتر قرار داده شد (طول موج nm595) و سپس دستگاه با این محلول صفر گردید.
هر کدام از نمونههای فوق در کوت ریخته شد و داخل دستگاه اسپکتروفتومتر قرار گرفتند و عدد قرائت گردید.
سپس از فرمول زیر غلظت پروتئینهای هر نمونه محاسبه گردید:
غلظت نمونه غلظت استاندارد
۳-۹. الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (تک بعدی)
در این نوع الکتروفورز پروتئینها بر اساس وزن مولکولی از هم تفکیک گردیدند.
۳-۹-۱. مواد مورد نیاز
منومراکریلآمید۱۰%، ۱.۵ Tris-HCL و ۰.۵ مولار، SDS، آمونیوم پرسولفات۱۰%، TEMED، Loading Buffer، Running Buffer، رنگآمیزی کوماسی بلو R-250 (محلول رنگآمیزی، محلول رنگبری) رنگآمیزی Blue Silver Staining (محلول تثبیت و محلول رنگآمیزی) و آب دوبار تقطیر
۳-۹-۲. آماده سازی مواد
منومراکریلآمید۱۰%: ۱۴۶ گرم از اکریلآمید با ۸/۰ از N-N-bis-metylen-acrylamid به ۵۰۰ میلیلیتر آب مقطر استریل اضافه گردید و با کاغذ واتمن، استریل شد.
Tris-HCL1.5 M, PH8.8: 54 گرم Trisbase با وزن مولکولی ۱۲۱ به ۳۰۰ میلیلیتر آب مقطر اضافه شد و در ۴ درجه سانتی گراد قرار گرفت.
Tris-HCL0.5 M, PH6.8: 5گرم Trisbase به ۱۰۰ میلیلیتر آب مقطر اضافه گردید.
Loading Buffer: 25/1 میلیلیتر Tris-HCL 0.5 M, PH6.8به ۵/۲ میلیلیتر گلیسرول اضافه گردید و سپس به آن ۲ میلیلیتر SDS10% و ۲/۰ میلیلیتر بروموفنول ۵% اضافه گردید و در نهایت ۵۵/۳ میلیلیتر آب مقطر به آن اضافه شد و قبل از استفاده به آن ۲۰ میکرولیتر از ۲-مرکاپتواتانول اضافه شد و حل گردید.
Running Buffer: این بافر طبق جدول زیر آماده گردید. PH بافر روی ۳/۸ تنظیم گردید (Rosenberg J.M., 2005).
جدول ۳-۵: مواد تشکیلدهنده Running Buffer10%
۱Lit
Components
۳۰.۳g
Tris base
