۳-۴-۱-۱۰- بررسی پایداری و تکرارپذیری پاسخ الکترودهای اصلاح شده نسبت به اکسایش الکتروکاتالیزوری گلوکز
در این کار به منظور بررسی تکرارپذیری حسگر ساخته شده در حین اندازه‌گیری‌های گلوکز، پاسخ آمپرومتری زیست‌حسگر تهیه شده با انجام ۷ اندازه‌گیری همراه با انجام محلول‌سازی بین هر اندازه‌گیری در غلظت ۳۵/۰ میلی‌مولار گلوکز در محلول چرخان بافر فسفات ۱/۰ مولار و در پتانسیل ثابت ۶۱۰- میلی‌ولت، مورد ارزیابی قرار گرفت و تکرارپذیری بالایی را (RSD برابر ۲/۹%) نشان داد.
همچنین به منظور بررسی میزان پایداری پاسخ حسگرهای ساخته شده در حین اندازه‌گیری‌های گلوکز، آمپروگرام الکترود اصلاح شده پس از تزریق گلوکز به محلول برای مدت زمان طولانی ثبت و مورد ارزیابی قرار گرفت. شکل (۳-۷۵ c) آمپروگرام زیست‌حسگر تهیه شده را در محلول چرخان بافر فسفات ۱/۰ مولار بعد از تزریق ۰/۳ میلی‌مولار گلوکز و در پتانسیل ثابت ۶۱۰- میلی‌ولت نشان می‌دهد. همان‌طور که دیده می‌شود بلافاصله پس از تزریق گلوکز، جریان افزایش و به مقدار ثابتی می‌رسد و پاسخ آمپروگرام حاصله پس از مدت زمان ۱۰۰۰ ثانیه به میزان ۳۸/۵% نسبت به مقدار اولیه تفاوت داشت که نشان دهنده پایداری خوب حسگر طراحی شده است.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

همچنین زیست‌حسگر طراحی شده پایداری پاسخ قابل قبولی را در طول زمان نگهداری نشان داد به گونه‌ای‌که وقتی الکترود اصلاح شده برای مدت زمان ۲ روز در دمای ۴ درجه سانتی گراد در محیط خشک نگهداری شد میزان پاسخ الکترود به اندازه ۸/۴% کاهش یافت و با گذشت مدت زمان ۲ هفته این میزان به ۱/۲۵% مقدار اولیه رسید.
به نظر می‌رسد پایداری خوب مشاهده شده از الکترود اصلاح شده مربوط باشد به ترکیب روش اصلاح کوالانسی و جاذبه الکترواستاتیک بکار برده شده در این روش که پایداری خوبی به الکترود می‌بخشد و از نشت آنزیم و حد واسط به محلول بافر جلوگیری می‌کند. این درحالی است که در بسیاری از زیست‌حسگرهای تهیه شده بر پایه آنزیم اشکال عدم پایداری و کنده شدن آسان لایه متصل شده به سطح الکترود وجود دارد [۱۸۵]. این مزیت ویژه منجر به کارایی بالای حسگر طراحی شده برای اندازه‌گیری گلوکز می‌شود. به‌علاوه بیان‌گر موفقیت روش پیشنهاد شده برای طراحی این گروه از زیست‌حسگرها می‌باشد
یک جنبه قابل توجه از الکترود اصلاح شده امکان انجام بازیابی الکترود تا مرحله‌ی اصلاح با گروه آمینو با قرار دادن الکترود اصلاح شده برای مدت ۱۰ دقیقه در حمام فراصوت و در محلول بازی سود با pH برابر ۰/۱۱ می‌باشد. در این حالت لایه اصلاح شده شامل آنزیم و پلیمر کیتوسان به همراه نانوذرات از سطح کنده می‌شود. این بررسی با گرفتن مقاومت ظاهری و مشاهده این‌که شکل منحنی حاصله شبیه حالت اصلاح شده با آمینوفنیل می‌گردد صورت گرفت. همچنین الکترود پس از بازیابی تا مرحله آمینو فنیل تحت اصلاح مجدد قرار گرفت و نتایجی مشابه با نتایج اولیه حاصل شد. بازیابی الکترود تا مرحله باز تولید آمینوفنیل به این دلیل امکان پذیر است که لایه آمینوفنیل با اتصال کوالانسی به سطح متصل گردیده است، این لایه خیلی محکم است و با قرار گرفتن تحت امواج فراصوت از سطح کنده نمی‌شود. با توجه به این‌که در روش اصلاح ارائه شده مراحل اصلاح الکترود تا مرحله‌ی ایجاد AP بر روی سطح زمان‌بر است و سایر مراحل ساده و سریع می‌باشد بنابراین در صورت از دست رفتن فعالیت آنزیم برای بازیابی زیست‌حسگر تهیه شده، نیاز به صرف زمان زیادی نیست. همان طور که می‌دانیم از دست رفتن فعالیت آنزیم بعد از مدت زمان نسبتا کوتاه یکی از مشکلات الکترودهای طراحی شده آنزیمی محسوب می‌شود و این امر باعث کم شدن طول عمر مفید این دسته از حسگرها می‌شود. بنابراین امکان بازیابی مجدد زیست‌حسگر طراحی شده یک مزیت ویژه محسوب می‌شود.
۳-۴-۲- تهیه زیست‌حسگر آنزیمی بر پایه نیل بلو پلیمره شده و انجام اصلاح لایه به لایه
الکترود اصلاح شده کامپوزیت (GCE/AP/MNP/PolyNB/GOx) نیز با بهر‌ه‌گیری از تلفیق روش اصلاح کوالانسی و روش تثبیت بر پایه اصلاح لایه به لایه ساخته شد. برای این منظور ابتدا الکترود اصلاح شده (GCE/AP/MNP/NB) تهیه شد. سپس با پلیمره نمودن نیل بلو قرار گرفته بر روی سطح الکترود اصلاح شده (GCE/AP/MNP/PolyNB) تهیه گردید. در نهایت با قرار دادن آنزیم گلوکز اکسیداز، زیست‌حسگر (GCE/AP/MNP/PolyNB/GOx) ساخته شد. در ادامه مراحل مختلف اصلاح شرح داده می‌شود.
۳-۴-۲-۱- تهیه الکترود اصلاح شده (GCE/AP/MNP/NB)
همان‌طور که قبلا بیان شد ابتدا سطح الکترود کربن شیشه‌ای با گروه آمینوفنیل (GCE/AP) اصلاح شد. الکترود اصلاح شده با گروه آمینوفنیل در محلول بافر با pH برابر ۰/۲ قرار گرفت و به این صورت سطحی پروتونه با بار مثبت ایجاد گردید. سپس ۰/۱ میکرولیتر از محلول سوسپانسیون MNP (1/0 گرم در ۵ میلی لیتر) بر روی سطح الکترود قرار گرفت و با عبور جریان گاز آرگون با خلوص بالا خشک گردید. به این دلیل که نانو ذرات مغناطیسی آهن دارای بار سطحی منفی هستند، می‌توانند به صورت الکترواستاتیک جذب سطح الکترود اصلاح شده با گروه آمینوفنیل با بار مثبت گردند. پس از شستشو با آب، ۰/۱ میکرولیتر از محلول ۰/۲ گرم بر لیتر حدواسط نیل بلو که یک حد واسط اکسایش- کاهش با بار مثبت سطحی است، بر روی سطحی که با نانو ذرات MNP با بار منفی پوشیده شده قرار گرفت و با عبور گاز آرگون خشک گردید. بعد از آن مقادیر اضافی نیل بلو با آب شستشه شد و رفتار الکتروشیمیایی الکترود اصلاح شده (GCE/AP/MNP/NB) با ولتامتری چرخه‌ای در محلول بافر فسفات ۱/۰ مولار بررسی شد. ولتامتری چرخه‌ای الکترود اصلاح شده با نیل بلو در محدوده پتانسیلی ۰ تا ۸/۰- ولت نسبت به مرجع نقره/نقره کلرید، رفتار مشخصه نیل بلو را نشان داد. شکل ۳-۷۵ این ولتاموگرام را طی روبش‌های مختلف نشان می‌دهد. مشکلی که در این‌جا قابل مشاهده است عدم پایداری الکترود اصلاح شده با نیل بلو طی روبش‌های متوالی پتانسیل می‌باشد به‌طوری‌که طی روبش‌های متوالی پتانسیل، از شدت جریان‌های ولتامتری نیل بلو کاسته می‌شود. با توجه به این‌که اصلاح الکترود تا مرحله تولید گروه AP بر روی سطح به صورت کوالانسی صورت می‌گیرد، نیل بلو قرار گرفته بر روی سطح نانو ذرات با این روش پایدار نیست و طی روبش‌های متوالی پتانسیل با کنده شدن آن از سطح نانو ذرات و یا همراه با آن و نشت آن به داخل محلول، از شدت جریان‌های ولتامتری مربوطه کاسته می‌شود. این مشکلی است که در بسیاری از روش‌های اصلاح بر پایه جذب فیزیکی از جمله روش اصلاح لایه به لایه مشاهده می‌شود. جهت تهیه حسگر با کارایی مناسب، مشکل پایداری الکترود باید به طریقی مرتفع می‌گردید. به نظر می‌رسد با ایجاد اتصالات عرضی بین مونومرهای اتصال یافته بر روی سطح بتوان ملکول‌های نیل بلو را به صورت محکمی بر روی سطح نگه داشت. لذا در این کار اثر پلیمره نمودن نیل بلو مورد بررسی قرار گرفت.
شکل ۳-۷۵- ولتاموگرام چرخه‌ای الکترود اصلاح شده GCE/AP/MNP/NB در ۱/۰ مولار بافر فسفات با pH برابر ۰/۷ در سرعت روبش ۲۰ میلی‌ولت بر ثانیه طی روبش‌های متوالی
۳-۴-۲-۲- تهیه الکترود اصلاح شده (GCE/AP/MNP/POLYNB)
الکترود اصلاح شده ((GCE/AP/MNP/NB به سل الکتروشیمیایی حاوی الکترولیت حامل بافر فسفات ۱۵/۰ مولار با pH برابر ۰/۶ منتقل شد و در محدوده پتانسیلی ۶/۰- تا ۲/۱ ولت نسبت به الکترود مرجع نقره/نقره کلرید ۵۰ ولتاموگرام چرخه‌ای و با سرعت روبش ۵۰ میلی ولت بر ثانیه پیمایش شد. همان‌طور که در شکل(۳-۷۶) نشان داده شده است رفتار ولتامتری طی مراحل پلیمره شدن مشابه آنچه در مورد نیل بلو اتصال یافته به سطح در بخش ۳-۲-۲ بیان شد صورت می‌گیرد. بنابراین با انجام روبش پتانسیل، مونومرهای موجود بر روی سطح طی مکانیسم ارائه شده در بخش ۳-۲-۳ پلیمره می‌شوند. مقدار پلیمره شدن بستگی به تعداد پیمایش‌های پتانسیل دارد. الکترود سپس با آب شسته شده و الکترود اصلاح شده (GCE/AP/MNP/PolyNB) تهیه گردید.
شکل ۳-۷۶- الکتروپلیمریزاسیون الکترود اصلاح شده GCE/AP/MNP/NB در بافر فسفات با ۰/۷=pH در سرعت روبش ۵۰ میلی‌ولت بر ثانیه
سپس رفتار الکتروشیمیایی الکترود اصلاح شده با ولتامتری چرخه‌ای در محلول بافر فسفات ۱/۰ مولار بررسی شد. شکل (۳-۷۷ A) ولتامتری چرخه‌ای الکترود اصلاح شده با پلی نیل بلو را در محدوده پتانسیلی ۰ تا ۸/۰- ولت نسبت به مرجع نقره/نقره کلرید نشان می‌دهد. ولتاموگرام حاصله در شکل با رفتار مشاهده شده در مقالات در تهیه پلیمر نیل بلو از مونومر آن مطابقت دارد[۱۷۲]. در سرعت روبش ۲۰ میلی‌ولت بر ثانیه، پتانسیل دماغه برای مونومر نیل بلو برابر ۴۰/۰- ولت و جدایی دماغه برابر ۱۱۵/۰ ‌ولت و پتانسیل دماغه برای پلیمر نیل بلو برابر ۲۰۵/۰- ‌ولت و جدایی دماغه برابر ۱۳۰/۰ ‌ولت محاسبه شد. مجددا میزان پایداری الکترود حاصله با انجام روبش‌های پتانسیل بررسی گردید. همان‌طور که در شکل(۳-۷۷ A) مشخص است با انجام پی در پی روبش‌های پتانسیل تا ۱۰۰ چرخه تغییر قابل مشاهده‌ای در شدت ولتاموگرام‌های حاصله ایجاد نمی‌شود که نشان دهنده پایداری قابل ملاحظه الکترود حاصله می‌باشد. علاوه بر این الکترود اصلاح شده GCE/AP/MNP/PolyNB پایداری زمانی قابل ملاحظه‌ای را نشان داد به‌طوری‌که بعد از گذشت ۳ ماه و گرفتن ولتامتری چرخه‌ای از سطح الکترود، ولتاموگرام حاصله تغییر چندانی نشان نداد شکل(۳-۷۷ B).
شکل ۳-۷۷- ولتاموگرام چرخه‌ای الکترود اصلاح شده GCE/AP/MNP/PolyNB در ۱/۰ مولار بافر فسفات با pH برابر ۰/۷ در سرعت روبش ۲۰ میلی‌ولت بر ثانیه (A) طی روبش‌های متوالی و (B) بعد از گذشت ۳ ماه
شکل (۳-۷۸) ولتاموگرام الکترود اصلاح شده با پلی نیل بلو را در سرعت روبش‌های ۲۰ تا ۱۰۰ میلی‌ولت بر ثانیه نشان می‌دهد. نتایج حاصله نشان می‌دهد که پتانسیل دماغه و مقدار جدایی دماغه برای پلیمر نیل بلو ثابت است و با تغییر سرعت روبش تغییری نمی‌کند.
۳-۴-۲-۳- تهیه الکترود اصلاح شده (GCE/AP/MNP/POLYNB/GOX)
الکترود اصلاح شده با آنزیم با افزودن ۰/۱ میکرولیتر از محلول حاوی ۰/۵ میلی گرم گلوکز اکسیداز در ۰/۱ میلی‌لیتر از بافر فسفات ۰۵/۰ مولار در pH برابر ۰/۷ بر روی سطح الکترود انجام شد. آنزیم گلوکزاکسیداز دارای بار سطحی منفی می‌باشد و جذب سطح الکترود اصلاح شده با پلیمر نیل بلو با بار مثبت می‌گردد. الکترود کامپوزیت تهیه شده با این روش با عنوان GCE/AP/MNP/PolyNB/GOx نام‌‌گذاری شد.
شکل ۳-۷۸- ولتاموگرام چرخه‌ای الکترود اصلاح شده GCE/AP/MNP/PolyNB در ۱/۰ مولار بافر فسفات با pH برابر ۰/۷ و در سرعت روبش‌های مختلف
۳-۴-۳- دنبال کردن مراحل اصلاح سطح الکترود با بهره گرفتن از ردیاب اکسایش - کاهش زوج فرو / فری سیانید
به دلیل این‌که مراحل مختلف اصلاح سطح با تغییر در بار سطح الکترود همراه است. بنابراین می‌توان از ردیاب اکسایش–کاهش زوج فرو/فری سیانید که باردار می‌باشد و می‌تواند نسبت به بار سطح حساسیت نشان دهد، برای دنبال کردن تغییرات سطح الکترود استفاده نمود. در این مرحله از ولتامتری چرخه‌ای این ردیاب برای دنبال کردن تغییرات سطح در هر مرحله از اصلاح استفاده شد. به این صورت که الکترود پس از اصلاح در هر مرحله‌ در محلول ۰/۱ میلی‌مولار پتاسیم فرو/ فری سیانید در ۰/۲=pH قرار گرفت و با انجام ولتامتری چرخه‌ای تغییرات سطح دنبال شد. همان‌طور که در شکل (۳-۷۹ a) نشان داده شده است، پس از اصلاح سطح الکترود کربن شیشه‌ای بر روی سطح گروه نیتروفنیل تشکیل می­ شود. گروه نیترو آب گریز همان‌طور که قبلا بیان شد سطح را نسبت به ردیاب غیر فعال می‌کند. در مرحله‌ی بعد اصلاح بر روی سطح گروه‌های آمینوفنیل (AP) داریم که می‌توانند در محیط اسیدی پروتونه و سطحی با بار مثبت ایجاد کنند. این امر باعث ایجاد یک پاسخ مشخص از ردیاب فرو‌سیانید در سطح الکترود می‌شود (۳-۷۹ b). با قرار گرفتن نانو ذرات مغناطیسی آهن بر روی سطح الکترود به دلیل پوشبده شدن سطح با این نانو ذرات و همچنین ایجاد بار منفی روی سطح باعث غیرفعال شدن سطح و کاهش دماغه ولتامتری ردیاب فرو/ فری سیانید می‌گردد. ولتاموگرام‌ حاصله در شکل (۳-۷۹ c) آورده شده است. بار مثبت موجود بر روی نیل بلو قرار داده شده بر روی سطح در مرحله‌ی بعد باعث افزایش پاسخ الکترود نسبت به ردیاب فرو/ فری سیانید می‌گردد(۳-۷۹- d). در نهایت با قرار گرفتن گلوکز اکسیداز بر روی سطح هم به دلیل پوشش بیشتر سطح و هم به دلیل بار منفی موجود بر روی این آنزیم سطح نسبت به این ردیاب غیر فعال‌تر می‌گردد(۳-۷۹- e).
شکل ۳-۷۹- ولتامتری چرخه‌ای از سطح الکترود در مراحل مختلف اصلاح در محلول ۰/۱ میلی‌مولار فری/فرو سیانید در pH برابر ۰/۲ و در سرعت روبش پتانسیل برابر ۱۰۰ میلی‌ولت بر ثانیه
۳-۴-۴- دنبال کردن مراحل اصلاح سطح الکترود با روش طیف‌سنجی مقاومت ظاهری
در این مرحله منحنی‌های مقاومت ظاهری (EIS) از مراحل مختلف اصلاح الکترود گرفته شد. این اندازه‌گیری‌ها در حضور ردیاب اکسایش–کاهش [Fe(CN)₆]^{3/4 –} در غلظت ۰/۵ میلی‌مولار، در بافر فسفات با pH برابر ۰/۲ صورت گرفت. اندازه‌گیری‌های EIS با قرار دادن منحنی‌های سینوسی با دامنه ۵ میلی‌ولت بر روی پتانسیل ثابت ۲۳/۰ ولت که پتانسیل فرمال ردیاب فرو / فری سیانید است، درمحدوده‌ی ۱۰ کیلو هرتز تا ۱۰۰ میلی هرتز انجام شد. شکل (۳-۸۰) منحنی‌های EIS را نشان می‌دهد که از مراحل مختلف اصلاح الکترود گرفته شده است. همان‌طور که در این شکل نشان داده شده است، تفاوت قابل توجهی بین ابعاد نیم دایره حاصل در مراحل مختلف اصلاح وجود دارد. در مرحله‌ی اول که الکترود با گروه نیتروفنیل پوشیده شده است، الکترود مقاومت انتقال بار بالایی را نشان می‌دهد. با تبدیل گروه نیترو به آمینوفنیل به دلیل جاذبه الکترواستاتیک قوی بین گروه‌های آمین با بار مثبت در سطح و ردیاب با بار منفی در محلول کوچکترین میزان ابعاد نیم دایره و در نتیجه کمترین مقاومت انتقال بار در سطح تماس مشاهده شد. با اصلاح الکترود با نانو ذرات مغناطیسی به دلیل نیروی
شکل ۳-۸۰- نمودار مقاومت ظاهری در مراحل مختلف اصلاح الکترود در محلول ۰/۵ میلی‌مولار فری/فرو سیانید با اعمال ولتاژ ac با دامنه ۵ میلی‌ولت در محدوده فرکانسی ۱۰ کیلو هرتز تا ۱۰۰ میلی هرتز. پتانسیل الکترود ۲۳/۰ ولت نسبت به مرجع Ag/AgCl انتخاب شد.
دافعه بین نانو ذرات با بار منفی و ردیاب، ابعاد نیم دایره و در نتیجه مقاومت انتقال بار افزایش یافت. ملکول‌های نیل بلو بار سطحی مثبت دارند و این امر باعث کاهش مقاومت انتقال بار در سطح الکترود می‌گردد. با ادامه مراحل اصلاح الکترود و قرار گرفتن گلوکز اکسیداز، به دلیل بار منفی موجود در سطح آنزیم و همچنین افزایش میزان پوشش سطح شاهد افزایش ابعاد نیم دایره و در نتیجه مقاومت انتقال بار در سطح الکترود بودیم.
بااستفاده از داده‌های ولتامتری و امپدانس می‌توان نتیجه گرفت که مراحل ایجاد گروه‌های آمینو فنیل بر روی سطح و قرار دادن نانو ذرات مغناطیسی بر روی آن و سپس قرار دادن پلیمر نیل بلو و قرار گرفتن آنزیم گلوکز اکسیداز بر روی سطح الکترود کربن شیشه‌ای با موفقیت انجام شده است.
۳-۴-۵- کاهش الکتروکاتالیزوری هیدروژن پراکسید در سطح حسگر GCE/AP/MNP/PolyNB
خواص الکتروکاتالیزوری حسگر طراحی شدهGCE/AP/MNP/PolyNB و برای احیای الکتروکاتالیزوری هیدروژن پراکسید با دو روش ولتامتری و آمپرومتری بررسی شد.
۳-۴-۵-۱- بررسی احیای الکتروکاتالیزوری هیدروژن پراکسید توسط حسگر طراحی شدهGCE/AP/MNP/POLYNB با روش ولتامتری چرخه‌ای
خواص الکتروکاتالیزوری الکترود کربن شیشه‌ای اصلاح شده نسبت به احیای هیدروژن پراکسید با بهره گرفتن از روش ولتامتری چرخه‌ای بررسی شد. برای این منظور ولتاموگرام‌های چرخه‌ای الکترود اصلاح شده در غیاب و در حضور هیدروژن پراکسید ثبت و مقایسه شدند.
شکل (۳-۸۱) ولتاموگرام‌های چرخه‌ای الکترود GCE/AP/MNP/PolyNB ، در غیاب و در حضور غلظت­های مختلف هیدروژن پراکسید در محلول ۱/۰ مولار بافر فسفات در pH برابر ۰/۷ و در سرعت روبش ۱۰ میلی‌ولت بر ثانیه را نشان می‌دهد. ولتاموگرام‌های به‌دست آمده از الکترود اصلاح شده با نیل بلو در غیاب و در حضور ۵/۰ میلی‌مولار هیدروژن پراکسید تغییر قابل توجهی را نشان می دهند. ملاحظه می‌شود که پس از افزودن هیدروژن پراکسید به محلول جریان دماغه کاهشی به‌شدت افزایش می‌یابد در حالی که جریان دماغه آندی حذف می‌شود. به علاوه اضافه ولتاژ لازم برای کاهش H₂O₂ به طور قابل ملاحظه‌ای در مقایسه با الکترود اصلاح نشده کربن شیشه‌ای (بخش‌های پیشین) کاهش می‌یابد. این مشاهدات نشان دهنده احیای الکتروکاتالیزوری هیدروژن پراکسید توسط الکترود GCE/AP/MNP/PolyNB است.
با توجه به مشاهدات بالا می‌توان مکانیسمی شبیه مکانیسم کلی احیای هیدروژن پراکسید توسط رنگ‌های فنوکسازین (مکانیسمEĆ) که قبلا بیان شد را برای احیای هیدروژن پراکسید توسط الکترود اصلاح شده GCE/AP/MNP/PolyNB پیشنهاد کرد. جریان کاهشی مشاهده شده مربوط به نفوذ هیدروژن پراکسید به سطح الکترود و واکنش آن با نیل بلو تثبیت شده بر روی سطح و اکسایش بعدی آن است.