ایران
گالیک اسید
Sigma
پروپیلن گلایکول
-
ایران
متانول
دکترمجللی
ایران
۳-۲- روش ها
۳-۲-۱- آماده سازی نمونه گیاهی مورد نیاز
برگهای گیاه گلرنگ پس از جمع آوری در دمای اتاق و دور از نور خورشید به طور کامل خشک و سپس توسط آسیاب برقی پودر و از الکی با مش ۱۰۰ عبور داده شده و در محلی تاریک، سرد و خشک نگهداری شدند.
شکل ۳-۱ بوته گلرنگ
شکل ۳-۲ برگ گلرنگ خشک شده
۳-۲-۲- استخراج ترکیبات آنتیاکسیدانی
جهت تهیه عصاره از برگ و گلهای گیاه از روش غرقابی و روش استخراج با دستگاه اولتراسوند، استفاده شد. حلال مورد استفاده در هر دو روش متانول ۸۰ درصد بود. متانول به عنوان حلال مؤثر به طور گسترده برای استخراج ترکیبات آنتیاکسیدانی از منابع گیاهی مورد استفاده قرار میگیرد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
۳-۲-۲-۱- روش ماسراسیون
۵ گرم نمونه پودر شده گیاهی با ۱۷۵ میلی لیتر متانول ۸۰ درصد ( نسبت ۱:۳۵ حجمی/وزنی ) طی مدت ۲۴ ساعت بوسیله دستگاه Shaker و در دمای محیط مخلوط شد. مخلوط بدست آمده با کاغذ واتمن شماره یک صاف گردید و عصاره صاف شده از این مرحله در دمای ۵-۲ درجه سانتیگراد برای حفظ ترکیبات فنولیک در یخچال نگهداری شد. در مرحله بعدی پودر گل گلرنگ عصاره گیری شده در در مرحله اول وزن گردید و به نسبت ( ۱۰_۱ حجمی/وزنی ) با حلال تازه ( متانول ۸۰ درصد ) توسط دستگاه در دمای محیط به مدت ۲۴ ساعت مخلوط گردید. مخلوط بدست آمده از مرحله دوم نیز همانند مرحله اول با کاغذ واتمن شماره یک صاف گردید و عصاره حاصل از مرحله دوم به عصاره حاصل از مرحله اول اضافه شد و در ادامه در دمای ۳۸ درجه سانتیگراد با دستگاه روتاری تغلیظ و سپس در آون تحت خلاء و در همان دما تا رسیدن به وزن ثابت خشک شد(۸).
۳-۲-۲-۲- استخراج با اولتراسوند
در فرایند استخراج با اولتراسوند، با هدف بهینهسازی شرایط استخراج فاکتورهای مؤثر در استخراج نظیر: دما، زمان و pH در سطوح مختلف مورد بررسی قرار گرفتند.
۳-۲-۲-۲-۱- نحوه تعیین سطوح pH
pH حلال مورد نظر، (متانول۸۰ درصد) برابر با ۳/۵= pH در دمای آزمایشگاه (˚C 21) بود. با اضافه کردن ۱ گرم ازپودر نمونه گیاهی، بعداز هم زدن مخلوط حاصل، pH در حد ۶ ثابت شد. از سوی دیگرخصوصیات آمفوتری که در مخلوط پودر گیاه و حلال وجود دارد، باعث می شود که بعد از اضافه کردن حجمهای کم از محلولهای بازی و اسیدی ضعیف شده، با همزدن نمونه، بازگشت pH به سمت pH طبیعی مشاهده شود. همچنین حجمی از محلولهای آمونیاک ۱ نرمال که به ۳۵ میلی لیتر از مخلوط حلال و نمونه اضافه میشوند باید باعث تغییر محسوس در حجم نهایی شوند. در نتیجه، حجم ۱۰۰ و ۲۰۰ ماکرولیتر از آمونیاک ۱ نرمال به ترتیب برای اعمال pH 7 و ۸ استفاده شد.
در نهایت، چون pH 8 به عنوان سطح بالای pH و pH برابر ۶ به عنوان سطح مرکزی درنظرگرفته شد، pH برابر ۷توسط نرم افزار Minitab به عنوان سطح پایین pH تعیین شد.
میزان نمونه به حلال، با توجه به استفاده از Sonotrode، مدل S2 قطر mm1 و حداکثر دامنه نوسان (Amplitude) برابر با ۲۶۰ میکرومتر، محدودیت استفاده حجمی بین CC50-2 وجود دارد، به همین خاطر حلال در یک نسبت ثابت ۱:۳۵ به ۱گرم پودر گیاه اضافه می شود (۲). دما در سه سطح (˚C 45، ˚C 30 و ˚C 15) انجام شد. زمان در سه بازه( ۵،۲۰ و ۳۵ دقیقه) انجام شد.
بر اساس طرح RSM، مدل Box-Behnken جهت کسب حداکثر اطلاعات، با انجام حداقل آزمایشات برای بررسی ۳ فاکتور در سه سطح انتخاب شد و بر اساس ۱۹ آزمون جهت بررسی روند میزان استخراج و تعیین شرایط بهینه انجام شد.
بعد از اضافه کردن حلال در صورتی که آمونیاک و اسید کلریدریک ۱ نرمال اضافه شود، همزدن تا زمانی که pH ثابت شود ادامه مییابد، سپس سطح بشر حاوی نمونه و حلال با پارافیلم پوشانده شد تا در حین فرایند التراسوند، تبخیر متانول آن از بشر تا حد امکان کاهش یابد.
بعد از پایان تیمار التراسوند، نمونه در داخل سلهای سانتریفوژ قرار گرفت و در سرعت rpm10000 و در دمای محیط به مدت ۳۰ دقیقه، سانتریفوژ شد. بعد از پایان سانتریفوژ، قسمت بالای مخلوط درون سلها که شفاف است، با Sampler جدا شد و در دمای C˚ ۳۵ درون Rotary evaporatore تغلیظ شد و در آون تحت خلأ، در شرایطی مشابه روش غرقابی، عصاره خشک شد.
جدول ۳-۳ _تیمارهای طراحی شده در آزمون سطح پاسخ بر اساس مدل باکس بنکن در ۳ فاکتور در سه سطح
شکل ۳-۳ نمونه تحت تاثیر امواج اولتراسوند
شکل ۳-۴ مرحله سانتریفوژ
شکل ۳-۵ حذف حلال توسط دستگاه تبخیر گردان تحت خلا
شکل ۳-۶ حذف نهایی حلال توسط آون تحت خلآ
۳-۳- آزمونهای شیمیایی
۳-۳-۱- اندازه گیری مقدار کل ترکیبات فنولیک
مقدار کل ترکیبات فنولیک در عصاره حاصل از دو روش استخراج غرقابی و التراسوند، بر اساس روش فولین سیوکالتیو مورد بررسی قرار گرفت(۳۳). برای تهیه محلولی از پودر عصاره خشک شده با غلظت ppm1000 در بالون ۱۰۰ میلی لیتر، و به ۱۰۰ میلیگرم از پودر عصاره خشک شده متانول ۸۰ درصد اضافه شد تا به حجم ۱۰۰ میلیلیتر برسد. سپس بالون روی Heater Magnetic قرار داده شد تا پودر عصاره به طور کامل در متانول حل شود.
برای آزمون فولین، عصارههای تهیه شده، ۱۰۰ میکرولیتر از محلول عصاره ppm1000 در لوله آزمایش ریخته شد و سپس ۵۰۰ میکرولیتر از محلول رقیق شده، معرف فولین سیوکالتیو به نسبت (۱۰/۱) اضافه شد. بعد از فاصله زمانی ۱ دقیقه، در دمای اتاق ۵/۱ میلی لیتراز کربنات سدیم ۲۰ درصد اضافه شد.
