F: AAGCCAAGAGAGGGTCGTTG
R: AGCGCAACATCCACAAACTATAAC

۲-۶ تهیه نمونه DNAی ژنومی
برای تهیه نمونه DNAی ژنومی، برگ­های تازه گیاه از گیاهچه­های ۱۴ روزه گیاه جو جدا شده و به مدت ۳ روز در دستگاه Dryfreez قرار داده شدند تا آب میان بافتی آن­ها کاملاً خشک شود. سپس نمونه­های برگی با دستگاه گریندر کاملاً پودر شده و برای استخراج DNA آماده شدند. DNAی ژنومی از نمونه گیاهی هر ژنوتیپ طبق روش سقائی و همکاران (۱۹۸۴) با اندکی تغییرات استخراج گردید.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

شکل ۲- ۵ گیاهچه­های ۱۴ روزه که برای تهیه نمونه برگی استفاده شدند.

شکل ۲-۷ دستگاه گریندر برای پودر کردن نمونه­های برگی
شکل ۲-۶ دستگاه Freezdryer برای خشک کردن
نمونه­های برگی
۲-۷ تعیین کیفیت و کمَیَت نمونه­ های DNA
کیفیت و کمَیَت نمونه­ DNA های استخراج شده روی ژل آگارز ۱% تعیین گردید. برای تعیین کیفیت DNA، یک میکرولیتر از DNAی ژنومی هر نمونه گیاهی همراه با ۲ میکرولیتر بافر لود کننده روی ژل آگارز لود شد. برای تعیین کمَیَت DNA از DNAی لامبدا استفاده گردید. صد نانوگرم از آن در یک سمت ژل و ۲۰۰ نانوگرم در سمت دیگر ژل همراه با نمونه­های DNA استفاده گردید. سپس از روی تصاویر ژل و با توجه به وضعیت DNAی لامبدا روی آن، غلظت نمونه­های DNA تخمین زده شد. شکل ۲-۸ تصویر ژل نمونه­های DNAی استخراج شده را نشان می­دهد. پس از تعیین غلظت استوک­های DNA، نمونه­های رقیق شده DNA با غلظت ۱۵ نانوگرم در میکرولیتر تهیه شد. برای رقیق کردن استوک DNA می­توان از آب استریل دوبار تقطیر و یا بافر ۱/۰ TE استفاده کرد اما برای توالی­یابی بهتر است از نمونه DNAهایی که با آب مقطر رقیق شده ­اند استفاده نمود (زیرا بافر TE موجب ایجاد برخی اختلالات در دنیچره شدن دو رشته­ DNA در محصول PCR می­گردد).
لامبدای ۲۰۰ نانوگرم لامبدای ۱۰۰ نانوگرم
شکل ۲-۸ تصویرژل نمونه­های DNA
-۸
۲-۸ واکنش زنجیره­ای پلیمراز برای تست پرایمرها
مناطق ژنومی محدود به توالی فوروارد و ریورس هر جفت پرایمر از طریق واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) تکثیر شده و محصولات PCR روی ژل آگارز مورد ارزیابی قرار گرفتند. مقادیر مواد مورد نیاز برای انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز در جدول ۲-۲ آورده شده است. این مواد از جمله بافر PCR، dNTP، MgCl2 و آنزیم DNA تک پلیمراز از شرکت فرمنتاز تهیه شده ­اند. پرایمرهای مورد استفاده در این آزمایش از شرکت WMG تهیه گردیدند. برای تکثیر قطعات ژنومی مورد نظر ابتدا یک چرخه دمایی ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت ۵ دقیقه، سپس ۱۰ چرخه دمایی شامل، دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ ثانیه، ۶۸ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ ثانیه و ۷۲ درجه سانتی گراد برای یک دقیقه اعمال گردید که در هر چرخه یک درجه دمای انلینگ (۶۸ درجه) کاهش یافته و پس از چرخه دهم این دما به ۵۸ درجه سانتی گراد تقلیل یافت. سپس ۳۵ چرخه شامل دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ ثانیه، ۵۸ درجه سانتی گراد ۳۰ ثانیه و ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت ۲ دقیقه اعمال گردید. در انتها ۵ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد قرار داده شد تا تکثیر قطعات تکمیل گردد. دستگاه PCR مورد استفاده در این آزمایش مدل ABI Vertri 96 بوده است. ABI Vertri 96 Thermal CyclerABI Vertri 96 Thermal Cycler ABI Vertri 96 Therm
شکل ۲-۹ دستگاه ترموسایکلر مدل
ABI Vertri 96
جدول ۲-۲ مواد مورد نیاز برای واکنش PCR

مواد مورد نیاز PCR

میزان مواد مورد نیاز (میکرولیتر)

DNA

۱

بافر

ا

dNTPs

۱ میکرولیتر

پرایمر فوروارد

۵/۰ (غلظت ۵ پیکومول)

پرایمر ریورس

۵/۰ (غلظت ۵ پیکومول)

آنزیم تک پلیمراز