غلظت مواد تنظیم کننده رشد در محیط کشت برای اندام زایی بسیار مهم است. اکسین با غلظت متوسط تا زیاد اولین هورمون مورد استفاده برای تولید کالوس است. غالباٌ از هورمون ۲,۴-D که اکسین بسیار نیرومندی است به تنهایی برای القاء کالوس استفاده می شود. در بعضی از گونه ها غلظت زیاد اکسین و غلظت کم سیتوکنین در محیط کشت روند تولید کالوس را ترقی می دهد. سیتوکنین های مورد استفاده کینتین یا بنزیل آدنین می باشند. بافت کالوس متشکل از گستره وسیعی از انواع واکوئل دار با تمایز نامنظم است که تعداد کمتری سلول های مریستمی در بین آنها پراکنده می باشد. ماهیت بافت کالوس به بافت ریزنمونه و یا بافت هایی که ریزنمونه از آن منشاء گرفته است و همچنین ترکیب محیط کشتی که برای تولید و نگهداری آن به کار می رود، بستگی دارد. کالوس را می توان با تهیه واکشت های مکرر برای مدت زمان طولانی نگهداشت اما ترکیب و ساختار آن ممکن است به مرور زمان تغییر کند. چرا که محیط کشت به نفع سلول های معینی عمل نموده و باعث غالب شدن آنها می شود. تحت شرایط رشد مناسب برای رشد سازمان نیافته سلول های مریستمی به طور تصادفی و پراکنده در بافت کالوس قرار دارند. انتقال قطعات کالوس به شرایطی که موجب رشد سازمان یافته می شود به تشکیل مریستموئیدها که مراکز رشد نیز نامیده می شود می انجامد. مریستموئیدها توده های متمرکزی از سلول های شبه کامبیومی هستند که ممکن است به دلیل ظهور سلول های تراکئیدی در مرکز، به آوند نیز مجهز شوند. این توده ها محل تشکیل اندام در بافت کالوس بوده و قادر به تولید ساقه یا ریشه می باشند. اندام زایی هم از سوسپانسیون سلولی و هم از کشت های کالوس امکان پذیر است. فقط لازم است سلول ها را از محیط کشت کالوس به محیط کشت خاص باززایی انتقال داده و سپس به طور مرتب در محیط باززایی تجدید کشت نمود. بنابراین اندام زایی با اثر متقابل کمی تعیین می گردد. بعبارت دیگر مقادیر نسبی مواد و نه مقادیر مطلق آن ها در رشد و نمو سهم دارند (فارسی، م. ج. ذولعلی. ۱۳۸۴).

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۲-۴-۷-۲-۱- تشکیل اندام نا به جا به طور مستقیم
بافت های رویشی گیاهان عالی تحت شرایط ویژه قادر به تولید گیاهان نا به جا می باشند. جوانه های نا به جا آنهایی هستند که مستقیماٌ از یک اندام گیاهی یا یک قطعه متعلق به آن و بدون نیاز به کالوس (به عنوان مرحله حدواسط) منشاء می گیرند. تولید ساقه های نا به جا به طور مستقیم بر روی ریشه، برگ، فلس های پیاز یکی از روش های مرسوم تکثیر گیاهان است. در محیط کشت نیز این روش بویژه برای گیاهان علفی مناسب است. تشکیل اندام های نا به جا به فعالیت مجدد ژن های مرتبط با فاز جنین زایی و نمو بستگی دارد (فارسی، م. ج. ذولعلی. ۱۳۸۴).
۲-۴-۷-۲-۲- جنین زایی
در جنین زایی سوماتیکی، جنین ها، سلول ها، بافت ها و یا اندام های سوماتیکی به طور غیر مستقیم (منشاء مجدد) یا مستقیم (منشاء نا به جا) باززایی می شوند که با فرایند جنین زایی زیگوتی جنین کاملاٌ متفاوت است. به طور کلی جنین های سوماتیکی آنهایی هستند که از بافت رویشی در محیط کشت تولید می شوند. جنین زایی سوماتیکی با اندام زایی متفاوت است زیرا جنین یک ساختار دوقطبی با انتهای ریشه ای بسته می باشد، ولی در اندام زایی یک ساختار تک قطبی تولید می شود. جنین از یک سلول منفرد منشاء می گیرد و فاقد ارتباط آوندی با بافت کالوس یا ریزنمونه ها می باشد. علاوه بر این القای جنین زایی سوماتیکی به یک محرک هورمونی خاص برای تشکیل یک ساختار دو قطبی که قادر به تولید گیاه کامل باشد، نیاز دارد در حالیکه در اندام زایی به دو محرک هورمونی مختلف، اول برای تولید ساقه و سپس برای تولید ریشه نیاز است. شارپ (Sharp) و همکاران در سال ۱۹۸۰ دو روش برای جنین زایی سوماتیکی توضیح دادند:

1. 1. جنین زایی مستقیم: در این حالت جنین مستقیماٌ از بافت ریزنمونه و بدون رشد کالوس منشاء می گیرد. این جنین از سلول های اولیه معینی به نام سلول های تعیین شده اولیه برای تولید جنین ایجاد می شود.

1. 1. جنین زایی غیر مستقیم: در این حالت جنین از بافت کالوس که از تکثیر سلول های ریزنمونه تولید می شود منشاء می گیرد. سلول هایی که به تولید جنین می پردازد سلول های تعیین کننده جنین القایی نامیده می شوند. از جمله این سلول ها می توان سلول های آبکش ثانویه در هویج، بافت های برگی قهوه، گل اطلسی، مارچوبه و … را برشمرد.

در اغلب موارد جنین زایی به روش غیرمستقیم می باشد. در این فرایند به مقادیر هورمونی مشخص و ایجاد شرایط ویژه برای شروع رشد کالوس و آماده سازی مجدد این بافت برای ورود به مرحله جنین زایی نیاز می باشد. فرایند جنین زایی رویشی مراحل مختلفی شامل تشکیل کالوس، نو جنین، بلوغ جنین و در نهایت تولید گیاهچه را در بر می گیرد. ترتیب محیط کشت های مورد استفاده و خصوصاٌ هورمونهای رشد نیز اهمیت فراوانی دارد. در بسیاری از گونه ها، یک محیط کشت برای تولید کالوس و نگه داری آن، محیط کشت دیگری برای بالغ شدن جنین سوماتیکی و محیط کشت سومی برای تبدیل این جنین به گیاه، لازم است. انتخاب ماهرانه ترتیب محیط های کشت در مواردی که جنین زایی سوماتیکی رخ نمی دهد و با مشکل انجام می شود ضروری است.
حضور اکسین در محیط کشت برای تشکیل جنین معمولاٌ ضروری می باشد. بافت ها یا کالوس هایی که به طور مداوم در محیط کشت بدون اکسین نگهداری می شوند، معمولاٌ تولید جنین نمی کنند. کالوس در محیط کشت غنی از اکسین تولید و تکثیر می شود. این محیط سبب تولید گروه های متمرکزی از سلول های مریستمی به نام توده های جنین زا (Embryogenic Clamps) می شود. تشکیل جنین های سوماتیکی معمولاٌ بعد از انتقال سلول ها یا کالوس ها به محیط فاقد اکسین یا دارای سطح کمتری از همان اکسین و یا سطح مشابه یا کمتر از یک اکسین ضعیف تر صورت می گیرد. بعد از انتقال به محیطی با اکسین کم یا فاقد اکسین، توده های جنینی به جنین بالغ تبدیل می شوند. در بعضی گیاهان بویژه گراس ها مراحل آغازش و نمو جنین در همان محیط کشت اول انجام می شود و انتقال به محیط غذایی دوم برای رشد جنین ها به گیاهچه لازم است.
جنین های سوماتیکی در محیط های کشت مختلفی از محیط کشت رقیق وایت گرفته تا محیط کشت غنی از نمک MS تولید شده اند، با این حال محیط کشت MS کاربرد وسیع تری داشته است. افزودن ازت احیاء شده به محیط کشت، هم به آغازش و هم به بلوغ جنین کمک می کند. از بین اسیدهای آمینه، فرم طبیعی اسید گلوتامین (L- glutamine) نقش ویژه ای ایفا می نماید. عامل دیگر کلات آهن در محیط کشت است. در غیاب آهن، نمو جنین از مرحله گلبولی شکل (globular) به مرحله قلبی شکل متوقف می شود. افزودن تنظیم کننده های رشد بویژه اکسین و یا اکسین به همراه سیتوکنین برای شروع رشد و القای جنین زایی الزامی است. از میان همه اکسین ها، هورمون ۲,۴-D و بعد از آن NAA بسیار مفید هستند.
از سیتوکنین ها نیز در محیط غذایی اولیه در خلال جنین زایی استفاده می شود. سیتوکنین ها در تسریع بلوغ جنین، بویژه در رشد و نمو کوتیلدون ها مؤثر هستند. در بعضی مواقع سیتوکنین ها برای رشد جنین و تبدیل آن به گیاهچه لازم است.
جیبرلین ها به ندرت در محیط کشت های اولیه استفاده می شوند. اما در بعضی از موارد نقش آنها در تسریع بلوغ جنین، تحریک ریشه دهی و مراحل بعدی رشد گیاه به اثبات رسیده است. نقش هورمون بازدارنده رشد ABA در جنین زایی سوماتیکی زمانی مشخص شده است که در مقادیر غیر بازدارنده مورد استفاده قرار گرفته است. این هورمون نمو و بلوغ جنین سوماتیکی را ترغیب می نماید و همزمان از تکثیر غیرعادی و ظهور جنین های فرعی و نا به جا ممانعت به عمل می آورد. افزودن آن به محیط کشت ممکن است بلوغ سوماتیکی را در شرایطی امکان پذیر سازد که در حالت طبیعی تحت آن شرایط بلوغ سوماتیکی اتفاق نمی افتد.
افزودن زغال فعال به محیط کشت اثرات مفیدی بر رشد و نمو جنین سوماتیکی دارد. محیط کشت های زغال دار مقادیر کمتری از ترکیبات فنیل استیک اسید و فروهیدروکسی بنزوئیک اسید که اثر بازدارنده بر فرایند جنین زایی سوماتیکی دارند نشان می دهند. همچنین ۵-هیدروکسی متیل فورفورال که از تجزیه ساکارز در حین اتوکلاو حاصل می گردد و یک ترکیب بازدارنده است، توسط زغال فعال جذب می شود. شرایط محیطی همچون نور، دما و تراکم سلول های جنین زا در محیط کشت، نیز مهم می باشند. با این حال نوع لوله های کشت، موقعیت جنین در محیط کشت (سطحی یا غوطه ور بودن) و حالت فیزیکی محیط کشت (نیمه جامد یا مایع) اهمیت چندانی ندارد (فارسی، م. ج. ذولعلی. ۱۳۸۴).
۲-۴-۸- کشت سوسپانسیون سلول های گیاهی
تاکنون مطالعات زیادی در زمینه تولید متابولیت های ثانویه از طریق کشت سوسپانسیون سلول های گیاهی به امید نیل به تولید تجاری متابولیت های ثانویه از این طریق صورت گرفته است. از مواردی که به تولید تجاری منجر شده است می توان به شیکونین از گیاه سنگ دانه ^[۵۱] اشاره کرد. به منظور القاء یا افزایش تولید درون شیشه ای ترکیبات ثانویه گیاهی تا کنون راهکارهای مختلفی مورد استفاده قرار گرفته است که برخی شامل موارد زیر است:

• • 1. 1. بهینه سازی محیط و شرایط محیط کشت
    1. 1. استفاده از سیستم های کشت دو مرحله ای
    1. 1. گزینش سلولی لاین های سلولی پربازده
    1. 1. کشت سلولی تثبیت شده^[۵۲]
    1. 1. استفاده از سیستم های کشت مبتنی بر بافت های تمایز یافته
    1. 1. تغذیه با پیش ماده ها و بیوترانسفورماسیون
    1. 1. رهاسازی محصول به درون محیط کشت
    1. 1. استفاده از محرک ها
    1. 1. نقشه یابی مسیرهای بیوسنتزی و مهندسی متابولیک (۴۹، ۶۵، ۱۰۰، ۱۲۳ و ۱۷۶خلیلی).

     

بدین ترتیب تاکنون ترکیبات ثانوی بسیاری از کشت سوسپانسیون سلول های گیاهی جداسازی گردیده است که به موارد زیر می توان اشاره کرد:
۲-۴-۹- تولید متابولیت های ثانویه در محیط درون شیشیه ای
متابولیت های ثانویه موادی هستند که مستقیماً مورد نیاز گیاه نیستند و در واکنش به حشرات، حیوانات علفخوار، تنش ها و … تولید می شوند. در حقیقت متابولیت های ثانویه در چارچوب چرخه های عادی گیاه (فتوسنتز، تنفس، تنفس نوری، سنتز پروتئین ها، چربی ها، تجزیه مواد و …) نمی گنجد. این مواد تنها در تعداد معدودی از گونه های گیاهی یا گاهی اوقات فقط در یک گونه یا یک رقم تشکیل می شوند. متابولیت های ثانویه اغلب ترکیباتی با مولکول حلقوی هستند. این مواد به عنوان دارو، چاشنی غذا، مواد بازدارنده و حشره کش از اهمیت اقتصادی ویژه ای برخوردار هستند.

1. 1. آلکالوئیدها

بیش از ۴۰۰۰ نوع آلکالوئید توسط گیاهان ساخته می شوند که برخی از آنها شامل آتروپین، استریکنین، نیکوتین و کوکائین می باشند.

1. 1. ترپنوئیدها

ترپنوئیدها شامل روغنهای فرار یا اسانس ها هستند.

1. 1. گلیکوزیدها

1. 1. از جمله گلیکوزیدها می توان به استروئیدها، فلاونوئیدها، ساپونینها، مواد فنولی، تاننها، کاردیاک گلیکوزیدها و … اشاره کرد.

متابولیتهای ثانویه زیادی از گیاهان استخراج می شود که در صنعت مورد استفاده قرار می گیرند. در جدول ۲-۱ گروه های مهم متابولیتهای ثانویه تجاری حاصل از گیاهان آمده است.
جدول۲-۱- گروه های اصلی ترکیبات مهم تجاری حاصل از گیاهان